植物miRNA提取分离试剂盒

产品货号：

WH0130

中文名称：

植物miRNA提取分离试剂盒

英文名称：

miRsmart Plant miRNA Isolation Kit

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒可从植物组织，特别是富含多糖多酚或淀粉的植物组织（如棉花叶片，马铃薯块茎，苹果，桃树叶片等）中快速提取包含miRNA的总RNA，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA纯度高，没有蛋白和其它杂质的污染。提取物可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆等多种下游实验。

试剂盒特点：

裂解液特别优化，并配有助沉剂，专为多糖多酚植物样本的裂解设计，得率更高。
柱法纯化，摆脱杂质污染，纯度更高，适合下游定量检测。
功能全面，除了小片段的提取，还能进行总RNA的提取。
1h内即可提取完毕，提高提取效率。

试剂盒组成：

组分	规格
裂解液SLM	30mL
助沉剂PLA	3mL
漂洗液RWA	12mL
去蛋白液MRD	24mL
RNase-Free ddH2O	15mL
RNase-Free过滤柱CS（含2mL收集管)	50套
RNase-Free吸附柱miRspin（含2mL收集管)	50套
RNase-Free吸附柱CR4（含2mL收集管)	50套
RNase-Free离心管（1.5mL)	50个

储存条件：室温（15～25℃)，加入β-巯基乙醇的裂解液SLM 4℃可放置一个月。

预防RNase污染，应注意以下几方面：

经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
配制溶液应使用无RNase的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1% （v/v)，放置过夜，高压灭菌)。

注意事项：

操作前在裂解液SLM中加入β-巯基乙醇至终浓度5%，如475μL裂解液SLM中加入25μL β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的试剂4℃可放置一个月。
第一次使用前应在去蛋白液MRD和漂洗液RWA中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
提取操作均在室温进行。

操作步骤：
第一次使用前在漂洗液RWA和去蛋白液MRD中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。

一、miRNA富集部分的提取
对miRNA的纯度要求较高时，比如miRNA芯片研究、miRNA克隆建议采用此方法。

匀浆处理
50mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，转入到1.5mL离心管中，加入500μL裂解液SLM（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），颠倒混匀以保证裂解液浸没所有样本，再加入1/10裂解液体积的助沉剂PLA，立即涡旋震荡混匀。
注意：
① 对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SLM用量增加至700μL。
② 由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的样本量。
室温，12000rpm（~13400×g)离心5min。
将上清液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中)，室温12000rpm（~13400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
量取转移液的体积，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇（如：500μL的转移液加215μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRspin中，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec。若一次不能全部加入到吸附柱miRspin中，请分两次转入，离心后弃掉吸附柱miRspin，保留流出液。
量取流出液的体积，缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇（如：700μL的流出液加525μL无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀）。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，若一次不能全部加入到吸附柱CR4中，请分两次转入，离心后弃掉流出液，保留吸附柱CR4。
向吸附柱CR4中加入700μL去蛋白液MRD（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
向吸附柱CR4中加入500μL漂洗液RWA（请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心30sec，弃废液。
重复操作步骤7。
将吸附柱CR4放入2mL收集管中，室温12000rpm （~13400×g)离心2min，去除残余液体。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR4在室温放置2min，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心2min。
注意：
① 洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。
② 如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。

二、Total RNA的提取
提取的total RNA中含有miRNA等small RNA。对miRNA的纯度要求不高时，比如在研究miRNA RT-PCR、miRNA Northern blot时也可以采用此方法。

匀浆处理
50mg植物叶片或果实果肉在液氮中迅速研磨成粉末，转入到1.5mL离心管中，加入500μL裂解液SLM （使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇)，颠倒混匀以保证裂解液浸没所有样本，再加入1/10裂解液体积的助沉剂PLA，立即涡旋震荡混匀。
注意：
① 对于预期RNA得率小于10μg的植物样本，请使用100mg的起始样本量；对于富含淀粉的样本或成熟叶片，请将裂解液SLM用量增加至700μL。
② 由于植物多样性非常丰富，而且同种植物的不同生长发育阶段和不同组织的RNA含量都不相同，请根据具体实验情况选择合适的样本量。
室温，12000rpm（~13400×g)离心5min。
将上清液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中)，12000rpm（~13400×g)离心2min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。
缓慢加入1.5倍上清体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀），将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR4中，12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。若一次不能全部转入吸附柱CR4，请分两步进行。
注意：如果上清液体积有损失，请相应调整无水乙醇的加量。
向吸附柱CR4中加入700μL去蛋白液MRD（使用前请检查是否已加入乙醇)，12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
向吸附柱CR4中加入500μL漂洗液RWA （使用前请先检查是否已加入乙醇)，12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR4放回收集管中。
重复步骤6。
将吸附柱CR4放入2mL收集管中，室温12000rpm （~13400×g)离心2min，去除残余液体。
注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR4在室温放置2min，或置于超净工作台上通风片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。
将吸附柱CR4转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加50μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12000rpm （~13400×g)离心2min。
注意：
① 洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。
② 如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次。

RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150 V，15min)检测完整性。由于细胞中70～80%的RNA为rRNA，电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。rRNA大小分别约为5 kb和2 kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA。植物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在1.8～2.1之间，比值为2.0是高质量RNA的标志。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD₂₆₀/OD₂₈₀读数1.8～2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5～1.9之间，但这并不表示RNA不纯。
浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-Free ddH2O稀释n倍，用RNase-Free ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行OD₂₆₀,OD₂₈₀测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：
终浓度（ng/μl)= （OD₂₆₀)×（稀释倍数n)×40

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